骨髓增生异常综合征中环形铁粒幼细胞增高

葛素君李绵洋康慧媛顾李霖潘玉玲刘改霞姜文灿梁爽王成彬

选自中华检验医学杂志,,40(02)

骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome,MDS)是一种恶性克隆性造血干/祖细胞性疾病，表现为难治性一系或多系细胞减少，其特征是病态造血、骨髓造血功能衰竭以及易于进展为急性髓系白血病[1]。它的发生是一个多因素、多阶段、累及多基因的病理过程。MDS具有高度异质性，不同分型乃至不同个体预后相差甚大，治疗效果也大相径庭。骨髓涂片环形铁幼粒细胞(ringsideroblast，RS)占有核红细胞≥15%为WHO分型标准之一，以往研究多限于对RARS生存预后的研究，而对伴RS增高的其他MDS亚型研究较少，RS在MDS预后中的意义尚不明确。本研究拟通过分析非RS增高MDS与伴RS增高MDS患者临床参数，检测骨髓细胞形态学，遗传学、分子生物学指标差异，随访患者生存情况，研究伴RS增高MDS生存预后及其预后影响因素。

对象与方法

一、对象

收集年3月至年12医院初诊MDS患者骨髓标本份，诊断标准按照世界卫生组织标准[2]。例MDS中男例，女67例，男女比例1.96∶1，年龄56(8～87)岁。

二、分组

将例RS占有核红细胞比例15%MDS患者组成非RS增高MDS(myelodysplasticsyndromewithoutringsideroblast,MDSRS－)组，将62例RS占有核红细胞比例≥15%MDS患者组成伴RS增高MDS(myelodysplasticsyndromewithringsideroblast,MDSRS＋)组。依据骨髓原始细胞数5%[3]，进一步将45例MDSRS－患者组成低原始细胞非RS增高MDS(myelodysplasticsyndromewithlowblastswithoutringsideroblast,MDS－LBRS－)组、52例MDSRS＋患者组成低原始细胞MDS伴RS增高(myelodysplasticsyndromewithlowblastsandringsideroblast,MDS－LBRS＋)组；根据骨髓原始细胞数≥5%，将91例MDSRS－患者组成非RS增高难治性贫血伴原始细胞增多(refractoryanemiawithexcessblastwithoutringsideroblast,RAEBRS－)组、10例MDSRS＋患者组成RS增高难治性贫血伴原始细胞增多(refractoryanemiawithexcessblastandringsideroblast,RAEBRS＋)组4组。另外，根据RS占个有核红细胞比例分为RS5%、5%～15%、15%～40%、RS≥40%4组。

三、仪器与试剂

骨髓形态检查中，瑞氏染料购自美国Sigma公司，显微镜为日本Olympus公司BX51型；染色体检查中，胎牛血清及RPMI均购自美国Hyclone公司，显微镜购自德国蔡司公司；基因分析中，Veriti定性PCR仪、型定量PCR仪、引物、MGB探针、定量PCR反应试剂(MasterMix)均购自ABI公司，定性PCR反应试剂(UniversitalMasterMix)购自美国Promega公司。

四、骨髓形态检查

油镜下计数每个标本的骨髓涂片细胞个，原始细胞计数按照髓系原始细胞在个有核细胞中所占比例计算；正常骨髓象红系所占比例为15%～25%[4]，本研究以红系所占比例≥35%为红系增生明显活跃；病态造血的评价根据世界卫生组织标准及《协和血液病学》[5,6]，油镜下计数粒系、红系及巨核系每系细胞中≥10%细胞存在病态被认为是病态造血，各系病态表现如下。(1)粒系：分叶过多、颗粒减少或增多、双核型粒细胞、环形杆状核粒细胞、假Pelger－Huet样畸形，假Chodiak－Higashi颗粒等，假Pelger－Huet样畸形为MDS常见病态；(2)红系：巨幼红样变、双核或多核(特别是奇数核)、大小核、核畸形、H－J小体、空泡变性、环形铁粒幼细胞等(图1)，核畸形为MDS常见病态；(3)巨核系：小巨核细胞、微小巨核细胞、单圆核、多圆核、多分裂核巨核细胞、低分叶小巨核等，小巨核、微小巨核、单圆核为MDS常见病态。

图1

MDS患者骨髓涂片结果

选择合格涂片进行骨髓内铁染色，参考《血液病实验诊断》及《全国临床检验操作规程》[7,8]，骨髓片置甲醛蒸气中固定3min，将等量40g/L亚铁氰化钾和4%盐酸溶液混合，新鲜配制加热至约56℃；将骨髓片放入其中30min后取出用流水冲洗，置碱性复红应用液中复染5min；依次用蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水冲洗，在空气中干燥后用显微镜检查；计算细胞内铁阳性水平(%)：计算每个患者个中、晚幼红细胞中铁粒幼细胞所占百分比；环形铁粒幼细胞阳性水平(%)：计算每个患者个中、晚幼红细胞中环形铁粒幼细胞所占百分比；铁染色环形铁粒幼细胞诊断标准[5]：沉积于胞质铁颗粒≥5个，并环核周≥1/3。

五、基因分析

取患者EDTA抗凝的骨髓标本2～3ml，按照TriPureIsolationReagent(瑞士Roche公司)操作步骤提取骨髓标本中RNA。采用反转录试剂盒(ReverseTranscriptionSystem，美国Promega公司)反转录合成cDNA，应用相关基因特异引物进行实时定量PCR扩增，进行分子生物学分析。所涉及的MDS经典异常基因包括：N－RAS、FLT3、GATA1、GATA2、EVI－1、TEL、MLL、p53及IRF－1突变、融合或异常表达等，其中N－RAS、MLL、FLT3、EVI－1等基因突变均为预后不良基因突变[9,10,11,12]。

六、染色体检查

取患者肝素抗凝骨髓标本2～3ml，按照1.5×个/L白细胞量接种培养液，培养24h，加入终浓度0.1μg/ml秋水仙碱，0.mol/ml氯化钾溶液中低渗30min，再以甲醇冰乙酸溶液固定3次，4℃过夜后制片，R显带核型分析，参照《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)》标准分析。应用德国蔡司公司染色体图像自动分析系统进行分析。所涉及的经典异常核型为－5/5q－，－7/7q－，＋8,20q－，－Y及复杂核型等[13]，其中－5/5q－，20q－，－Y与正常核型为预后较好核型，复杂核型及累及7号染色体异常为预后较差核型，其余异常为预后中等核型。

七、随访

所有患者自确诊之日进行随访观察，死亡患者随访至死亡日，存活患者随访至年3月20日，随访时间为31(2～85)个月。存活期按确诊至死亡时间或确诊至年3月20日。随访资料来源于住院病历、门诊病历及电话联系。

八、统计学分析

采用SPSS16.0统计学软件进行数据处理：计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验、连续校正卡方检验或Fisher确切概率法；计量资料以±SD或中位数(四分位数)表示，组间比较采用t检验或Wilcoxon秩和检验；生存分析采用Kaplan－Meier法和COX回归模型检验。P0.05为差异有统计学意义。

结果

一、MDSRS＋组与MDSRS－组临床参数、骨髓细胞学、遗传学及分子生物学特征比较

临床参数：MDSRS＋组与MDSRS－组相比，性别、初诊时血红蛋白水平差异无统计学意义(P0.05)；发病年龄、初诊时白细胞和血小板计数高(P0.01)。骨髓细胞计数及病态造血：MDSRS＋组比MDSRS－组红系增生程度及巨幼变阳性率高，差异有统计学意义(P0.05)；粒系和巨核系常见的病态造血细胞阳性率差异无统计学意义(P0.05)。遗传学及分子生物学特征：两组之间核型分布(好、中、差)及基因异常率差异均无统计学意义(P0.05)，见表1。

表1

MDSRS－组与MDSRS＋组患者临床参数、骨髓病态造血、遗传学及分子生物学特征对比

二、MDS－LBRS＋组与MDS－LBRS－组临床参数、骨髓细胞学、遗传学及分子生物学特征比较

临床参数：MDS－LBRS＋组与MDS－LBRS－组相比，性别与初诊时血红蛋白水平差异不明显(P0.05)；发病年龄、初诊时白细胞和血小板计数高(P0.05)。骨髓细胞计数及病态造血：MDS－LBRS＋组比MDS－LBRS－组红系增生程度及巨幼变阳性率高，差异有统计学意义(P0.05)。遗传学及分子生物学特征：与MDS－LBRS－组相比，MDS－LBRS＋组患者基因异常率更高，尤其是GATA1基因异常(P0.05)，见表2。

表2

MDS－LBRS－组与MDS－LBRS＋组患者临床参数、骨髓病态造血、遗传学及分子生物学特征对比

三、RAEBRS＋组与RAEBRS－组临床参数、骨髓细胞学、遗传学及分子生物学特征比较

临床参数：RAEBRS＋组与RAEBRS－组相比，性别、年龄及初诊时血红蛋白水平差异不明显(P0.05)，初诊时白细胞计数高(P0.01)。骨髓细胞计数及病态造血：RAEBRS＋组比RAEBRS－组红系增生程度高，差异有统计学意义(P0.05)。遗传学及分子生物学特征：RAEBRS＋组比RAEBRS－组核型分布较差(P0.05)，两组之间基因异常率无明显差异(P0.05)，见表3。

表3

RAEBRS－组与RAEBRS＋组患者临床参数、骨髓病态造血、遗传学及分子生物学特征对比

四、生存分析结果

截至年3月20日，70例MDS中，44例死亡，12例进行骨髓移植，移植患者多为RAEB，且仅有1例死亡，其余均存活，移植患者生存情况均较好，故本研究仅统计非移植患者的生存情况。对各组患者进行生存分析，MDSRS－组中位生存时间为22个月，MDSRS＋组中位生存时间为14个月(图2)；MDS－LBRS－组中位生存时间为25个月，MDS－LBRS＋组中位生存时间为19个月(图3)；RAEBRS－组中位生存时间为15个月，RAEBRS＋组中位生存时间为7个月(图4)，各组生存情况比较虽无统计学差异，但伴RS增高组与非RS增高组相比，生存情况呈较差的趋势。

图2

MDSRS－组与MDSRS＋组患者的Kaplan－Meier生存曲线

图3

MDS－LBRS－组与MDS－LBRS＋组患者的Kaplan－Meier生存曲线

图4

RAEBRS－组与RAEBRS＋组患者的Kaplan－Meier生存曲线

将年龄、白细胞、骨髓原始细胞、环形铁粒幼细胞、基因和染色体全部引入COX回归模型进行分析，结果多因素生存分析显示RS对MDS生存预后有独立意义(P0.05)(表4、图5)。

表4

多变量COX回归分析

图5

MDSRS－组与MDSRS＋组患者Kaplan－Meier生存曲线

根据RS占有核红细胞比例分组进行生存分析，各组生存情况虽无明显统计学差异，但RS≥40%组患者较15%～40%组生存情况呈较差趋势(图6)。

图6

RS5%、5%～14%、15%～40%、RS≥40%四组MDS患者的Kaplan－Meier生存曲线

讨论

MDS具有高度异质性，很多因素影响MDS预后，尤其是WHO分型，而RS占有核红细胞百分比(≥15%)是MDS分型的一个重要指标[14]，难治性贫血伴环形铁粒幼细胞增高(refractoryanemiawithringsideroblast,RARS)是MDS中预后较好的亚型之一[15]，但其与预后较好的难治性贫血(refractoryanemia,RA)亚型生存预后差异鲜有报道，RS在MDS预后中的意义尚不明确。本研究发现RS≥15%是MDS预后较差的影响因素，提示RS增高可能与MDS患者预后、转归密切相关，可应用于MDS病情评估、疾病监测和预后评价。这可能与MDSRS＋患者体内铁过载明显，造成机体氧化应激，影响细胞增殖分化有关，但RS影响MDS预后的机制仍待进一步研究。也有研究[16]认为RS为MDS预后较好的影响因素，但多因素生存分析无意义，且认为生存预后可能与多系病态造血及染色体核型异常相关；本研究中MDSRS－组与MDSRS＋组染色体核型及粒系、巨核系病态造血细胞阳性率均无差异，且多因素分析RS在MDS中有独立意义，本研究分析RS在MDS中的作用更具说明性。

对RS与其他MDS预后指标的相关性做进一步分析，发现MDSRS＋患者的不良预后可能与发病年龄、骨髓病态造血、分子生物学等因素相关。目前认为年龄、诊断时血红蛋白水平和白细胞数为MDS预后指标[17]。骨髓无效造血是MDS的主要病理生理机制，粒系、红系及巨核系病态造血在MDS预后中起重要作用[18]。WHO分型及IPSS积分均将细胞遗传学纳入标准，揭示了染色体核型在MDS预后中的重要意义。目前越来越多的文献报道基因突变和异常表达也能作为分子生物学标志来评估预后，MLL突变、NRAS突变、p53突变、KIT,GATA1,EVI1基因高表达等与MDS疾病进展密切相关，为MDS预后不良分子生物学标志[9,10,11,12,19]。

本研究发现MDSRS＋组患者发病年龄较高、初诊时白细胞和血小板水平较高，提示发病年龄在MDSRS＋预后中有重要意义。MDS患者外周血细胞的减少可反映MDS无效造血，本研究MDSRS＋患者白细胞和血小板水平相对较高，间接说明了RS可能主要影响红系造血，对粒系和巨核系影响不大。

进一步研究发现伴RS≥15%组骨髓红系增生程度和巨幼变更加明显，但粒系、巨核系常见的病态造血细胞阳性率及比例均无明显差异，也证明RS主要影响红系造血而不影响粒系及巨核系，这可能与铁过载抑制MDS红系祖细胞增殖，而不影响粒、巨核系祖细胞有关[20,21]。无效性红细胞易发生原位溶血，是MDS高铁负荷的形成机制，过高的铁负荷增加RS形成及MDS转为白血病的概率，加快MDS进程，因此红系病态造血可能是MDSRS＋预后的主要影响因素。

本研究发现MDS－LBRS＋组患者基因异常率较MDS－LBRS－组更高，尤其是GATA1基因，提示基因异常可能是MDSRS＋预后不良的影响因素。这些基因的突变导致癌基因的激活、抑癌基因的失活和转录调节异常，从而影响MDSRS＋的进展、预后和转归。但目前针对RS的相关性基因研究还较少。RAEBRS＋组与RAEBRS－组间基因异常率无明显差异，但不良染色体核型比例较高，可能是RAEBRS＋组病例数少的原因，有待进一步扩大样本量进行研究。

综上所述，MDSRS＋患者生存预后较MDSRS－患者差。发病年龄高、红系病态造血明显以及预后相关基因异常率高可能是MDSRS＋预后不良的影响因素，而伴RS增高也可能是MDS预后不良的独立因素。MDSRS＋患者铁过载明显，易造成机体氧化应激，影响细胞增殖和分化，使MDS发展为AML的风险率增加，并且治疗反应性差[22,23,24]。去铁治疗可以有效的改善MDSRS＋患者的红系病态造血，是治疗MDSRS＋的主要方法之一[25]。我们将进一步研究RS在MDS预后中的独立意义，RS的发生机制，以及去铁治疗在MDSRS＋治疗中的意义，为研究MDSRS＋的靶向治疗提供新思路。

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长按







































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本文编辑：佚名
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